维瑞医药公司最新研发—“维生素类新药”-“儿童类新药”-“感冒类新药”-“心脑血管类新药”-“中药品种”-“保健食品”
内容 一、杂质来源及分类
二、杂质检查方法的选择及建立
三、杂质限度技术要求及控制
一、杂质来源与分类
1、概述
任何影响药物纯度的物质统称为杂质，杂质研究是药品研发的一项重要内容。它包括选择合适的分析方法，准确地分析判断与测定杂质的含量并综合药学、毒理及临床研究的数据结果确定杂质的合理限度。这一研究贯穿于药品研发的整个过程（药物的整个合成工艺、药物制剂处方工艺、药物结构及其性质、分析方法）
2、杂质分类：
药品中的杂质按其理化性质一般分为三类：有机杂质、无机杂质及残留溶剂。
按照其来源，杂质可以分为工艺杂质（包括合成中未反应完全的反应物及试剂、中间体、副产物等）、降解产物、从反应物及试剂中混入的杂质等。
按照其毒性分类，杂质又可分为毒性杂质和普通杂质等。
杂质还可按其化学结构分类，如其它甾体、其它生物碱、几何异构体、光学异构体和聚合物等。
3、检测方法
有机杂质包括工艺中引入的杂质和降解产物等，可能是已知的或未知的、挥发性的或不挥发性的。由于这类杂质的化学结构一般与主药成分类似或具渊源关系，故通常又可称之为有关物质。本课件主要以有机杂质为例进行方法的选择与建立进行讲解。在进行杂质研究时首要问题是选择合适的杂质分析方法。这个方法的选择直接关系到杂质测定结果的专属性与准确性。
杂质的检测方法目前普遍采用的方法有高效液相色谱法（HPLC）、薄层色谱法(TLC)、气相色谱法(GC)和毛细管电泳法（CE）。本课件主要以高效液相色谱法为例进行讲解。
二、分析方法的建立与验证
1、杂质检查方法的初步筛选建立
在方法的筛选和优化研究中需要完成三部分的工作，即确定分离和检测条件、确定待测样品的制备方法以及杂质的定量方法。首先参考药典（欧洲药典 (EP)、美国药典（USP）、英国药典 (BP)、日本药典（JP）、中国药典 (ChP)）以及文献方法（CNKI、维普等数据库）进行初步筛选，为适应主成分杂质分离的需要，需要对流动相比例、流动相pH值、流动相的成分、流速、柱温或将等度洗脱修改成梯度洗脱等试验参数进行适当的调整和优化，在必要条件下与制剂协调更换辅料等方式初步确定色谱条件的可行性。对创新型药物要根据原料药的合成工艺初步分析药品中可能存在的工艺杂质，同时根据主药的结构分析其可能的降解途径及降解产物，在此基础上根据主药及杂质的理化性质、化学结构及杂质的控制要求等考虑选用合适的检查方法。
2、方法的优化及确定
为进一步验证方法的可行性，需要对初步筛选的方法进行验证。在制剂处方工艺未成熟前，先采用原料、已知杂质及上市品进行摸索，过程：
a.先将原料进行破坏试验：酸碱氧化高温光照破坏，即可以考察主药中杂质谱来源，同时考察主药的降解情况以及降解杂质与主峰以及杂质与杂质之间的分离情况确定方法的可行性，再者同时考察主药的稳定性情况，为以后的储存条件做参考；
b.以上破坏试验若获得的降解杂质与主峰及相邻杂质的分离度良好，需要进一步的预实验，在此条件基础上将上市品进行破坏，不能因为原料破坏试验结果良好，就确定方法的可行性，还需要通过上市样品和自制样品进一步考察方法的专属性。（CY在进行盐酸溴己新方法预实验时将国内外药典实验时，原料破坏试验实验均良好，但是上市样品及自制样品均出现峰型异常情况，最后这些方法不可行后，最后采用惠氏方法来进行有关物质检查。在进行愈创木酚甘油醚甘油醚有关物质考察时，原料破坏实验良好，但是上市样品由于所采用香精不同问题，对此方法有严重的干扰现象，所以上市品不能采用此方法检测，最后自制样品在不影响处方工艺杂质质量基础上通过适当调整不同口味香精。）
c.以上实验完成后，再通过自制样品的全面破坏试验进一步验证方法的完善。在
选择酸、碱、双氧水溶液浓度或者高温光照条件时，需要根据药物的理化性质及对酸碱氧化情况的稳定进行确定，不同品种药物对以上几种溶液的敏感性是不同的，实验初期需要先配制小浓度的溶液进行实验，待试验后根据破坏情况再适当调整溶液的浓度，使主药的破坏程度在10％～ 30％，需要一个实验的过程来确定，并且对我们制定储藏条件也有参考价值。
以上在自制样品破坏试验完成后，如果降解杂质与主峰达到基线分离并且已知杂质与相邻杂质峰也可以达到基线分离，方法可以建立了，接下来就可以进行方法学验证了。（专属性、检测限、定量限、线性、已知杂质的回收率、耐用性、精密度、范围等进行一步的验证）
3、在方法的建立和验证过程中，需要关注以下几个问题 ：
a.采用高效液相色谱法进行检查时，使用二极管阵列检测器（PDA）是非常有必要的，通过PDA检测器可获得各杂质的紫外光谱信息，有利于综合判断杂质检测波长选择的合理性，避免杂质的漏检，同时还要进行峰纯度检查，保证主峰与杂质峰的峰纯度，避免定量测定时数据有偏差。
b.检测波长的选择应考虑主要杂质的最大吸收，而不是主药的最大吸收，同时，应使主药和各主要杂质的响应差异最小。如果主药和各主要杂质的响应差异较大，比方说超出了 0.9 ～ 1.1 的范围时，在采用主成分自身对照法进行杂质定量时需要加校正因子。此外，如用紫外检测波长低波长检测时，还应考虑有机相中有机溶剂比如甲醇乙腈的截止使用波长，一般205nm以下禁止使用。
c.适当的破坏试验帮助判断考察分析方法对降解产物的检出能力，也可用于考察主药的降解途径和降解产物。只是破坏试验的目的不是使主药成分完全降解，而只是要产生少量的降解产物，通常在敏感条件下主药成分降解10％～ 30％较为合适，过分降解将产生一些在生产和贮存条件下不可能生成的二级甚至三级降解产物，对色谱条件的筛选不利。在破坏试验中应还要关注物料平衡情况，有时由于降解产物和主药的响应可能存在差异或降解产物无法被检出、降解产物可能进一步降解以及存在多条降解途径等原因，物料不平衡的现象也较为常见，需要进行新方法的模索。
4.在方法验证的耐用性试验中应对色谱系统的适用性进行考察，并通过耐用性试验，考察系统适用性参数(例如分离度、拖尾因子、理论塔板数等)是否满足高效液相色谱法的要求，以保证在任何时候使用该分析方法都是有效的。
三、杂质限度技术要求及控制
1、杂质限度的参考依据
限度制定应有充分的依据，并要综合考虑。确定了药物的剂量后，可以根据降解产物的阈值来制订杂质的限度，如果没有可参考的药典标准或者国家标准，可参照ICH(人用药品注册技术要求国际协调会)的相关要求制订杂质限度：
附件1：原料药的杂质限度
|
最大日剂量 |
报告限度 |
鉴定限度 |
质控限度 |
|
≤2g |
0.05% |
0.10%或1.0mg （取最小值） |
0.15%或1.0mg （取最小值） |
|
>2g |
0.03% |
0.05% |
0.05% |
附件2：制剂的杂质限度
|
报告限度 |
最大日剂量 |
≤1g |
>1g |
||
|
限度 |
0.1% |
0.05% |
|||
|
鉴定限度 |
最大日剂量 |
<1mg |
1mg-10mg |
>10mg-2g |
>2g |
|
限度 |
1.0％或5μg （取最小值） |
0.5％或20μg （取最小值） |
0.2％或2mg （取最小值） |
0.10% |
|
|
质控限度 |
最大日剂量 |
<10mg |
10mg-100mg |
>100mg-2g |
>2g |
|
限度 |
1.0％或50μg （取最小值） |
0.5％或200μg （取最小值） |
0.2％或3mg （取最小值） |
0.15% |
|
备注：
报告限度（Reporting Threshold）：
报告限度是指所有高于此阈值的杂质及其含量均应在每批产品的检验报告中记录,并在申报资料中反映。
鉴定限度（Identification Threshold）：
超出此限度的杂质均应进行定性分析，确定其化学结构。
质控限度（Qualification Threshold）：
质控限度是指只要质量标准中制订的杂质限度不高于此限度,就不需要提供该限度的制订依据,认为该限度是合理的。
2、仿制国内已上市的药物 ( 已有国家标准 )这类药物有关物质的限度
主要根据国家标准制订，同时可参考技术先进国家药典的收载情况或国外产品标准，再结合药物工艺和处方进行必要的稳定性试验研究后制订其限度。自制产品与已上市原研产品的杂质对比研究是论证杂质安全性和限度的较为简便的方法。另外，对于特定杂质的限度也可引用药典标准、 文献进行限度制定。
3、仿制国外上市的药物 ( 国内没有上市，没有国家标准 )
这类药物杂质限度的制订比较复杂，如果能查到国外上市药物的标准情况，杂质限度的制订即可以参照执行。如果没有这方面的数据，需要根据ICH杂质限度制定要求，在进行相关的研究后，再制定合理的限度。
4、已知杂质化合物的毒性数据
对于已知杂质化合物，可参考相关的文献，或数据库查得其毒性数据，并根据药品临床拟用的剂量推算药物的安全限度。
5、杂质限度制定举例
以愈酚溴新口服溶液为例：愈创木粉甘油醚杂质限度的制定参照美国药典35版愈创木粉甘油醚原料质量标准制定：
CY项目中：愈创木酚甘油醚最大日用量为300mg，盐酸溴己新12mg：
愈创木酚甘油醚：报告限度、鉴定限度、质控限度分别：0.1%，0.2%，0.2%
盐酸溴己新：报告限度、鉴定限度、质控限度分别：0.1%，0.2%，0.5%
愈创木粉甘油醚杂质限度：供试品溶液的色谱图中如有杂质峰（盐酸溴己新和苯甲酸钠以及相对愈创木酚甘油醚主峰保留时间0.6倍前的峰不计），相对愈创木酚甘油醚主峰保留时间1.4倍的杂质A（愈创木酚）不得过0.1%；相对愈创木酚甘油醚主峰保留时间0.8倍的杂质B（2-（2-甲氧基苯氧基）-1,3-丙二醇不得大于对照溶液愈创木酚甘油醚主峰面积（1.0%）；其他单个杂质峰面积不得大于对照溶液愈创木酚甘油醚主峰面积的0.5倍（0.5%）；各杂质峰面积（除杂质B外）的和不得大于对照溶液愈创木酚甘油醚主峰面积（1.0%）。
分析：以ICH的要求单个杂质的质控限度为0.2%，但是美国药典标准中杂质A的限度为0.1%（比ICH严格），杂质B的限度为1.0%（比ICH限度宽），均不符合ICH的要求，在这种情况就可以参考的美国药典标准来制定限度。
盐酸溴己新杂质限度：供试品溶液中如有杂质峰，相对盐酸溴己新主峰保留时间0.9倍处的的杂质不得大于对照溶液主峰的面积（1.0%）；单个最大杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积0.5倍（0.5%）。各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的2倍（2.0%）。
分析：以ICH的要求单个杂质的质控限度为0.5%，但是参考惠氏质量标准标准中相对主峰保留时间0.9的杂质限度为1.0%，也不符合ICH的要求，所以要以已有国家标准的标准进行控制。
药物杂质研究检查方法与杂质限度相关问题
1、药物研究杂质检查包括哪些杂质？
（答案：有机杂质、无机杂质、溶剂残留）
2、杂质检测方法有哪几种？
（答案：高效液相色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、毛细管电泳法）
3、高效液相色谱法检查有关物质有几种定量计算方法？
（答案：外标法、加校正因子的自身对照法、不加校正因子的自身对照法、面积归一化法）
4、报告限度、鉴定限度、质控限度的区别？
（答案：报告限度：超出此限度的杂质均应在检测报告中报告，并应报告具体的检测数据。
鉴定限度：超出此限度的杂质均应进行定性分析，确定化学结构。
质控限度：质量标准中一般允许的杂质限度，如制订的限度高于此限度，则应有充分的依据。）
5、杂质定量测定要进行哪几项验证内容？
（答案：专属性、定量限、线性、准确度、精密度、范围和耐用性）
陈焕玲
2015.4.11
